Os testes para detecção da infecção pelo HIV podem ser divididos basicamente em quatro grupos:
● detecção de anticorpos;
● detecção de antígenos;
● cultura viral; e
● amplificação do genoma do vírus.
As técnicas rotineiramente utilizadas para o diagnóstico da infecção pelo HIV são baseadas na detecção de anticorpos contra o vírus. Estas técnicas apresentam excelentes resultados e são menos dispendiosas, sendo de escolha para toda e qualquer triagem inicial. Porém detectam a resposta do hospedeiro contra o vírus, e não o próprio vírus diretamente. As outras três técnicas detectam diretamente o vírus ou suas partículas. São menos utilizadas rotineiramente, sendo aplicadas em situações específicas, tais como: exames sorológicos indeterminados ou duvidosos, acompanhamento laboratorial de pacientes, mensuração da carga viral para controle de tratamento, etc. A seguir, cada técnica será explicada separadamente.
Testes de detecção de anticorpos
· ELISA (teste imunoenzimático): este teste utiliza antígenos virais (proteínas) produzidos em cultura celular (testes de primeira geração) ou através de tecnologia molecular recombinante. Os antígenos virais são adsorvidos por cavidades existentes em placas de plástico e, a seguir, adiciona-se o soro do paciente. Se o soro possuir anticorpos específicos, estes serão fixados sobre os antígenos. Tal fenômeno pode ser verificado com a adição de uma antiimunoglobulina humana conjugada a uma enzima como, por exemplo, a peroxidase. Em caso positivo ocorre uma reação corada ao se adicionar o substrato específico da enzima. Esta técnica é amplamente utilizada como teste inicial para detecção de anticorpos contra o vírus, devido à sua facilidade de automação e custo relativamente baixo. Apresenta atualmente altas sensibilidade e especificidade.
· Western-blot: este ensaio envolve inicialmente a separação das proteínas virais por eletroforese em gel de poliacrilamida, seguida da transferência eletroforética dos antígenos para uma membrana de nitrocelulose. Em um terceiro momento, a membrana é bloqueada com proteínas que são adsorvidas por sítios não ocupados pelos antígenos. Posteriormente a membrana é colocada em contato com o soro que se deseja pesquisar. As reações antígeno-anticorpo são detectadas por meio da reação com antiimunoglobulina humana, conjugada com um radioisótopo ou uma enzima. A revelação é feita por auto-radiografia ou por substrato cromogênico. Geralmente este teste é utilizado para confirmação do resultado reagente ao teste ELISA (ou seja, teste confirmatório da infecção), devido à sua alta complexidade e custo. Tem alta especificidade e sensibilidade.
· Imunofluorescência indireta: fixadas em lâminas de microscópio, as células infectadas (portadoras de antígenos) são incubadas com o soro que se deseja testar. Depois, são tratadas com outro soro que contenha anticorpos específicos para imunoglobulina humana (anti-lg) conjugados a um fluorocromo. A presença dos anticorpos é revelada por meio de microscopia de fluorescência. Também é utilizada como teste confirmatório.
· Radioimunoprecipitação: a detecção dos anticorpos decorre de reações com antígenos radioativos. Estes antígenos são obtidos de células infectadas, mantidas na presença de radioisótopos durante a síntese de proteínas virais. Precipitados formados da reação desses antígenos com anticorpos específicos são sedimentados, dissociados com detergente, e depois, analisados por eletroforese em gel de poliacrilamida. Segue-se a auto-radiografia. É uma técnica menos conhecida, mas que pode ser utilizada para confirmação de diagnóstico.
· Outros testes para detecção de anticorpos: um grande número de testes rápidos para estudos de campo, triagens de grandes populações e para decisões terapêuticas em situações de emergência vêm sendo desenvolvidos, geralmente baseados em técnicas de aglutinação em látex e hemaglutinação.
Testes de detecção de antígeno VIRAL
Pesquisa de Antígeno p24: este teste quantifica a concentração da proteína viral p24 presente no plasma ou no sobrenadante de cultura de tecido. Embora esta proteína esteja presente no plasma de pacientes em todos os estágios da infecção pelo HIV, sua maior prevalência ocorre antes da soroconversão e nas fases mais avançadas da doença; o teste é realizado mediante a utilização da técnica de ELISA (imunoenzimático).
Técnicas de cultura viral
· Cultura de células mononucleares de sangue periférico para isolamento do HIV: esta técnica foi inicialmente utilizada para caracterizar o HIV como agente causador da aids. As culturas são observadas quanto à evidência de formação sincicial (células gigantes multinucleadas), presença de atividade da transcriptase reversa e produção de antígeno p24 em sobrenadantes. São consideradas positivas quando dois testes consecutivos detectam a presença dos achados acima descritos em valores superiores ao limite de corte (cut-off).
· Cultura quantitativa de células: é uma técnica que mede a carga viral intracelular, mediante a diluição seriada decrescente de uma população de 106 células do paciente infectado. Considera-se como positiva a menor diluição capaz de isolar alguma célula infectada
· Cultura quantitativa de plasma: técnica semelhante à anterior, porém utilizando alíquotas decrescentes de plasma. Considera-se como positiva a menor diluição capaz de infectar células mononucleares.
Testes de amplificação do genoma do vírus
Análise quantitativa direta da carga viral através de técnicas baseadas na amplificação de ácidos nucleicos, tais como a reação de polimerase em cadeia (PCR) quantitativa, amplificação de DNA em cadeia ramificada (branched-chain DNA ou bDNA) e amplificação seqüencial de ácidos nucleicos (nucleic acid sequence-based amplification ou NASBA). Embora as técnicas sejam diferentes, o PCR quantitativo e o NASBA apresentam alta sensibilidade, permitindo o acompanhamento da resposta terapêutica antiretroviral. Além disso, valores elevados de partículas virais detectados ao PCR quantitativo ou NASBA parecem estar relacionados com um maior risco de progressão da doença, independente da contagem de células TCD4+. Sugere-se sua monitorização a cada 3-4 meses. Em caso de início ou mudança de terapia antiretroviral, alguns autores recomendam uma dosagem da carga viral com 1 a 2 meses de tratamento, para avaliação da resposta ao esquema. Os resultados devem ser interpretados da seguinte maneira:
· Carga viral abaixo de 10.000 cópias de RNA por ml: baixo risco de progressão ou de piora da doença.
· Carga viral entre 10.000 e 100.000 cópias de RNA por ml: risco moderado de progressão ou de piora da doença.
· Carga viral acima de 100.000 cópias de RNA por ml: alto risco de progressão ou de piora da doença.
Contagem de células CD4+ em sangue periférico
A contagem de células T CD4+ em sangue periférico tem implicações prognósticas na evolução da infecção pelo HIV pois é a medida de imunocompetência celular; é mais útil no acompanhamento de pacientes infectados pelo HIV. De maneira didática pode-se dividir a contagem de células T CD4+ em sangue periférico em quatro faixas:
· maior que 500 células/mm3: estágio da infecção pelo HIV com baixo risco de doença. Há boa resposta às imunizações de rotina e boa confiabilidade nos testes cutâneos de hipersensibilidade tardia, como o PPD. Casos de infecção aguda podem apresentar estes níveis de células T CD4+, embora, de modo geral, esses pacientes tenham níveis mais baixos.
· entre 200 e 500 células/mm3: estágio caracterizado por surgimento de sinais e sintomas menores ou alterações constitucionais. Risco moderado de desenvolvimento de doenças oportunistas. Nesta fase, podem aparecer candidíase oral, herpes simples recorrente, herpes zoster, tuberculose, leucoplasia pilosa, pneumonia bacteriana.
· entre 50 e 200 células/mm3: estágio com alta probabilidade de surgimento de doenças oportunistas como pneumocistose, toxoplasmose de SNC, neurocriptococose, histoplasmose, citomegalovirose localizada. Está associado à síndrome consumptiva, leucoencefalopatia multifocal progressiva, candidíase esofagiana, etc.
· menor que 50 células/mm3: estágio com grave comprometimento de resposta imunitária. Alto risco de surgimento de doenças oportunistas como citomegalovirose disseminada, sarcoma de Kaposi, linfoma não-Hodgkin e infecção por micobactérias atípicas. Alto risco de vida com baixa sobrevida.
Observações
· Estes valores levam em conta apenas a avaliação quantitativa. Alterações qualitativas na função dos linfócitos podem permitir o surgimento de condições oportunistas em pacientes com níveis diferentes de células T CD4+.
· Em crianças, a contagem de células T CD4+ tem níveis diferentes de interpretação.
· Quando não há disponibilidade de quantificação da carga viral, pode-se basear na contagem de células T CD4+ para iniciar ou alterar terapêutica anti-retroviral.
· Soroconversão: é a positivação da sorologia para o HIV. A soroconversão é acompanhada de uma queda expressiva na quantidade de vírus no plasma (carga viral), seguida pela recuperação parcial dos linfócitos T CD4+ no sangue periférico. Esta recuperação é devida tanto à resposta imune celular quanto à humoral. Nesta fase observa-se o seqüestro das partículas virais e das células infectadas (linfócitos T-CD4+) pelos órgãos linfóides responsáveis por nossa imunidade, particularmente os linfonodos.
· Janela imunológica: é o tempo compreendido entre a aquisição da infecção e a soroconversão (também chamada de janela biológica). O tempo decorrido para a sorologia anti-HIV tornar-se positiva é de seis a 12 semanas após a aquisição do vírus, com o período médio de aproximadamente 2,1 meses. Os testes utilizados apresentam geralmente níveis de até 95% de soroconversão nos primeiros 5,8 meses após a transmissão.
